Wykorzystanie i porównanie molekularnych i klasycznych metod do identyfikacji pleśni izolowanych z gleby
Autor
Michał Piegza, Joanna Rząsa, Ewelina Siepka, Danuta Witkowska
Strony
3–16
Słowa kluczowe
pleśnie, Trichoderma sp., RAPD, RFLP, metody molekularne
Streszczenie
Pokaż streszczenie
W prezentowanej pracy skupiono się na porównaniu metod identyfikacji mikroorganizmów, w tym przypadku podobieństwa pomiędzy szczepami, z wykorzystaniem klasycznych metod płytkowo-mikroskopowej i molekularnej. Obie metody zastosowano, opierając się na założeniu potwierdzonym w ostatnim czasie wskazującym na znaczne zróżnicowanie w obrębie rodzaju Trichoderma, utrudniającym dokładną morfologiczną identyfikację. Obecnie kładzie się również silny nacisk na molekularną identyfikację gatunków. Porównanie metod klasycznej i molekularnej oparto na zastosowaniu typowych wyznaczników makro- i mikroskopowych oraz molekularnych RAPD i RTLP-PCR. Rezultaty wskazały, iż żadna z zastosowanych metod nie jest do końca adekwatna, jednak dokładniejsze wyniki uzyskano, stosując metodę wykorzystującą techniki molekularne. Niestety, nie zaobserwowano powiązania pomiędzy RAPD i RFLP, a ich zderzenie wręcz komplikowało interpretację wyników. Eliminacją tych problemów może być zastosowanie innych markerów molekularnych
Przedmiotem badań był preparat owoalbuminowy stanowiący produkt uboczny uzyskiwany podczas wydzielania lizozymu i cystatyny z białka jaja kurzego, które poddano hydrolizie enzymatycznej. Początkowo oceniono podatność tego białka na działanie handlowych preparatów proteinaz: termolizyny, pronazy i neutrazy oraz enzymów proteolitycznych pozyskanych z dyni figolistnej (Cucurbita ficifolia) oraz z drożdży Y. lipolytica: serynowej i aspartylowej proteinazy. Do dalszej hydrolizy wykorzystano trzy ostatnie enzymy. Rozkład białka śledzono podczas 24-godzinnej inkubacji enzymu z substratem, oznaczając stopień jego hydrolizy i przyrost wolnych grup aminowych, a także prowadząc rozdział chromatograficzny metodą RP-HPLC. Stwierdzono, że najgłębszą degradację preparatu owoalbumi- nowego na poziomie 45% uzyskano pod wpływem proteinazy serynowej z dyni. Wyraźnie niższą aktywność wobec tego białka przejawiały obydwie proteinazy drożdżowe. Profile peptydowe RP-HPLC uzyskanych hydrolizatów potwierdziły różnice w podatności preparatu owoalbuminy na działanie testowanych enzymów proteolitycznych.
Celem pracy było zbadanie stanu mikrobiologicznego wędzonych serów regionalnych gołka wywarzanych z niepasteryzowanego mleka owczo-krowiego w rejonie Karpat oraz dokonanie wstępnej identyfikacji występujących w nich bakterii fermentacji mlekowej. Stan mikrobiologiczny gołek określano na podstawie wyników oznaczeń liczebności tlenowych bakterii mezofilnych, bakterii fermentacji mlekowej (LAB), Staphylococcus aureus oraz drożdży i pleśni. W gołkach badano też obecność bakterii Salmonella i Listeria. Liczebność poszczególnych grup drobnoustrojów oznaczano metodą posiewową, a obecność bakterii będących wskaźnikiem bezpieczeństwa mikrobiologicznego wy- krywano metodą ELFA. Skład rodzajowy LAB gołek określano na podstawie wyników analizy metagenomowej. Analizę tę prowadzono metodą PCR z zastosowaniem specyficznych rodzajowo starterów. Dominujące LAB identyfikowano ponadto na poziomie gatunku metodą PCR-RFLP i sekwencjonowania. Przeprowadzone badania wykazały, że mikroflora gołek wytwarzanych przez różnych producentów miała zbliżony skład ilościowy. Najbardziej liczna była w niej populacja kwasolubnych LAB. W badanych gołkach było ich średnio 6,9x109 jtk٠g-1. We wszystkich gołkach znajdowało się też od 1,2x106 do 1,6x107 jtk٠g-1 drożdży. W żadnej gołce nie wykryto obecności bakterii Salmonella, Listeria, enterotoksycznych S. aureus oraz pleśni. W gołkach występowały natomiast LAB z rodzaju Enterococcus, Lactococcus, Lactobacillus i Leuconostoc. Wśród 166 szczepów LAB wyizolowanych z gołek dominowały bakterie Lb. casei.